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梅毒螺旋體熒光抗體吸收試驗(FTA-ABS)診斷試劑



錄入時間:2022-6-20 15:47:27 來源:現代微生物培養基和試劑手冊

【原理】

  梅毒感染后,一般經過2~4周的潛伏期在侵入部位出現第1個臨床癥狀-硬下疳,此時體內多已產生可以檢出的特異抗體,首先是IgM型,同時伴有IgG型,隨著病程的進展,IgG型抗體逐漸升高,至第2期達頂點,以后稍有下降,但一直保持。而且,只要感染過程存在,體內即有 IgM抗體產生,當治療后感染過程終止,IgM型抗體即消失。因此,檢測病人特異IgG型和IgM型抗體,可以確定是否梅毒感染,而在梅毒治療過程中,IgM型抗體從陽性轉為陰性,則是梅毒治愈的標志,但治療后IgG型抗體可終身保持,并能被FTA-ABS法檢出。FTA-ABS試驗,是國際上公認的檢出梅毒特異抗體的首選方法,其敏感性和特異性均高于其它方法。如對一期梅毒、晚期潛伏和三期復發梅毒的檢出敏感性均高于VDRL法。本法以完整的梅毒密螺旋體(Nichols標準毒株)作為抗原,涂于載玻片上,然后加病人血清與之反應,如血清中有特異抗梅毒螺旋體抗體,則必與玻片上的梅毒螺旋體結合,再加上抗人免疫球蛋白熒光抗體,梅毒螺旋體就會被此熒光抗體包被,于熒光顯微鏡下即可見發特異熒光的形態典型的梅毒螺旋體。

  由于人體內(如口腔、陰道)棲居有其它密螺旋體,它們有時也可引起局部感染,使體內產生相應的抗體,其中部分與梅毒螺旋體有交叉反應。因此,當血清稀釋度不高時(如1:5~1:50),?墒姑范緹晒饪贵w試驗(FTA)出現一定比例的假陽性,而當血清稀釋至1:100~1:200時,又可將部分真的梅毒感染漏檢。于是,自1969年開始,采用無毒密螺旋體Re-iter株培養液吸收血清中群交叉抗體,使血清在1:5稀釋時不會產生交叉反應,從而既提高了方法的特異性,又不降低敏感性。此法即FTA -ABS (Fluorescent Treponemal antibody-absorption)。經過國際上約20年的廣泛應用,證明它是血清學方法中一種最成功的方法。僅在美國,每年用此法檢驗的血清標本數達數千萬份之多。根據美國疾病控制中心(CDC)的研究,FTA-ABS的敏感性對一期梅毒為98%,二期為100%,潛伏期為100%,三期(晚期)為96%,對各期的特異性則達98%(95%~99%)。


【成分及制法】

  1.FTA抗原:為從感染梅毒螺旋體標準毒株(Nichols)的家兔睪丸中提取的純螺旋體,或直接涂于特制載玻片上(此載玻片為10眼、6眼、4眼等型號),經丙酮固定后保存備用;其螺旋體密度為高倍視野20~30條,并襯有羊紅血球作背景,或凍于瓶中,低溫保存。由使用者自己涂制抗原片方法如下:將干燥抗原加滅菌蒸餾水1ml,振蕩至完全溶解,以吸管吸打8~10次,使螺旋體凝團均勻分散,然后涂制抗原基片;用特制或自己用鉆石筆刻劃的限圈載玻片,每圈涂1白金耳抗原,室溫干燥15分鐘以上,隨即浸入優級丙酮中10分鐘以固定螺旋體(每200ml丙酮固定的玻片不應多于50張);水溶后此抗原應當全部涂制玻片固定后干燥保存于低溫下備用(可置于小干燥器中或密封于塑料袋內置冰箱)。

  2.FTA陽性對照血清:為標準化的凍干的已經1:5稀釋的梅毒病人FTA- ABS陽性血清,在試劑盒啟用初期可與待測的血清同時染色,其螺旋體的熒光亮度應達“++”以上(即螺旋體形態清晰,黃綠色熒光明顯)。凍干血清根據瓶簽說明稀釋。

  3.FTA吸收劑:為特制的用以抑制非特異交叉反應的非致病性密螺旋體培養浸液,以0.2ml加待測熱滅活血清0.05ml,成1:5稀釋。

  4.羊抗人或兔抗人IgG和/或IgM熒光抗體:為FITC標記的球蛋白,凍干制品0.5ml包裝。用時以雙蒸水重溶,然后小量(0.2ml)分裝凍存備用?谷IgGFA可用于各期梅毒的檢測,指示抗梅毒螺旋體IgG抗體的存在,抗人IgMFA 可用于早期及未治療的活動性梅毒的檢測,抗梅毒螺旋體IgM抗體的存在,表明體內有梅毒螺旋體活動。

熒光抗體水化后,取0.1ml按瓶簽指示稀釋,對陽性血清染色,用自己的熒光顯微鏡觀察熒光強度,如強度不足,可降低稀釋度,如強度很高,則可加大稀釋度。用時設FA直接染抗原的陰性對照。

  5.吐溫80:用以制備熒光抗體稀釋液。將吐溫與9.8ml磷酸鹽緩沖液分別于水浴加溫至56℃,然后吸0.2ml吐溫至緩沖液中,充分沖洗吸管,混勻,pH應為7.0~7.2,置冰箱中可長期保存,如pH改變或產生沉淀則棄之。

  6.封片劑:為純甘油與pH8.6緩沖鹽水按9:1混合而成。熒光抗體染色完成后,用毛細管吸取滴加在抗原涂區,量不必過多,以能擴散至蓋片全區又不使蓋片漂動為宜。此封片劑也可用作鏡油。

  7.磷酸鹽緩沖液(PBS):將30g干粉溶于2670ml蒸餾水中,加入1.5ml預熱的吐溫80用作試驗血清的稀釋和染色玻片的浸泡。

  8.FTA吸收劑對照:為與梅毒螺旋體有交叉反應的非梅毒病人血清,以PBS1:5稀釋,可使螺旋體染成陽性,而用吸收劑稀釋,則為陰性,本對照可證明吸收劑的可靠性。


【用途】

  (1)檢出各期(從早期到晚期)梅毒病人體液(血、腦脊液等)中的抗梅毒螺旋體的特異IgGIgM抗體,用以確定梅毒感染診斷和監測療效。

  (2)供血者檢查。

  (3)各種健康査體和婚前檢査。


【注意事項】

  1.本試驗的標本為病人或被檢查者的血清。試驗前血清須56℃滅活30分鐘,已滅活過的血清也須于試驗當天再滅活10分鐘。

  2.試驗程序:

  (1)抗原片質量檢查:利用試劑盒提供的瓶裝干燥抗原自已涂制的抗原片,染色前應用暗視野顯微術觀察一下螺旋體的密度和分布情況,如密度太低或螺旋體成團塊者,應重新用吸管或注射器反復抽吸,使螺旋體充分散開,涂制的抗原每高倍視野應不少于10條。

如直接用試劑盒提供的抗原片,則不須檢查,可直接進行染色,但從冰凍中取出的抗原片,必須徹底干燥。并緩慢通過酒精燈火焰2次(以不燙手為度)。

  (2)將已滅活的待測血清以吸收劑1:5稀釋(0.05ml血清加0.2ml吸收劑),充分混合后于37℃下放置20分鐘,使非特異性交叉反應抗體被充分吸收,即取20~30μl加于抗原涂膜上,使涂膜完全覆蓋。

陽性和陰性對照血清均分別以PBS和吸收劑同上作1:5稀釋處理,然后加于抗原膜上。

熒光抗體對照則于抗原膜上加PBS或吸收劑。

  (3)將以上涂片置于濕盒內,密蓋,于35~37℃下孵育30分鐘。

  (4)置涂片于玻片架上,以流動PBS沖洗去除已經反應的血清或對照液,然后浸于PBS5分鐘,提拉10次,再換水重復浸洗1次。

  (5)以蒸餾水沖洗5秒鐘,吸干。

  (6)以2%吐溫緩沖液稀釋抗人熒光抗體至工作濃度,每涂膜加10~20μl覆蓋。

  (7)重復3、4步驟。

  (8)以封片劑封片,防止壓入氣泡。

  (9)熒光顯微鏡檢查,宜盡早完成,不能及時鏡檢的涂片須放置于冰盒內。

  (10)如結果全為陰性,應以暗視野顯微術或普通顯微術檢查一下是否有螺旋體存在。

  3.報告結果:鏡檢熒光抗體染色的熒光發射強度,是一個相對值,與熒光顯微鏡的光學系統密切相關,熒光強度的比較,只能在同一裝置內進行才有意義,因此,相對熒光強度的判定應以所用熒光顯微鏡對已知陽性標本的染色情況來加以標化,觀察結果一般分3種:

  (1)陽性:螺旋體的熒光強度在1+4+之間,1+指熒光足以使螺旋形態典型,邊界清晰可見。2+以上的熒光強度則有很強的隨意性,其差別并無本質上的意義。

  (2)邊界:熒光強度<1+,即弱但肯定。

  (3)陰性:可見背景發紅色熒光的血球但見不到螺旋體,或僅有模糊影像。1+和<1+的標本宜重試1次(陰性標本不必重試),如重試時為1+或更強,則報告為:“ FTA-ABS陽性;如不足1+則報告為:“FTA-ABS陰性。

  如有必要,強陽性標本可做稀釋度測定。熒光抗體可用抗人IgG或抗人IgM,根據診斷要求而定。

(軍事醫學科學院微生物流行病研究所黃策編 第二軍醫大學 謝正旸審)

 

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